分子生物學試劑在基因測序技術中扮演著至關重要的角色，其核心作用貫穿了從樣本處理、文庫構建到測序反應的全過程。
1.樣本處理與核酸提取
（1）裂解與純化
裂解試劑：
化學裂解液（如胍鹽、表面活性劑）：破壞細胞膜和核膜，釋放核酸。
酶解法（如蛋白酶K、溶菌酶）：降解與核酸結合的蛋白質（如組蛋白）。
物理輔助（如珠磨法、超聲破碎）：通過機械力加速細胞裂解。
純化試劑：
硅膜吸附柱：利用硅膠膜特異性吸附DNA/RNA，去除雜質（如蛋白質、多糖、抑制劑）。
磁珠法：磁性納米顆粒結合核酸，通過磁性分離快速純化。
緩沖液系統(tǒng)（如高鹽低pH）：優(yōu)化核酸與雜質的結合差異，提升純度。
（2）核心作用
確保核酸的完整性（避免斷裂）和高純度（去除PCR抑制劑），為后續(xù)步驟提供高質量模板。
2.文庫構建（LibraryPreparation）
（1）核酸片段化
酶法片段化：
DNaseI：隨機切割DNA鏈，產生平末端或粘性末端。
轉座酶（Tagmentation）：同時完成片段化和接頭添加（如Nextera技術）。
超聲片段化：
超聲波將DNA打斷為特定長度片段（如100~500bp），需配合穩(wěn)定劑（如Covaris試劑盒）。
（2）接頭連接與修飾
接頭（Adapter）：
包含測序引物結合位點、索引序列（Index）和標簽序列，用于區(qū)分不同樣本。
T4DNA連接酶：催化DNA片段與接頭的共價連接。
末端修復：
Taq聚合酶：填補5'端突出末端，生成鈍末端。
Klenow酶：修復3'端凹槽并加dA尾（與TruSeq接頭匹配）。
磷酸化與連接效率增強劑：
ATP和T4PNK酶：對接頭進行5'磷酸化，提高連接穩(wěn)定性。
（3）核心作用
確保文庫的均一性（片段長度一致）和特異性（接頭正確連接），避免測序偏差。
3.分子生物學試劑測序反應中的試劑
（1）PCR擴增與富集
PCR試劑：
HotStartTaq酶：減少非特異性擴增，提高文庫富集效率。
dNTPs：提供DNA合成原料，需平衡濃度以避免錯誤摻入。
Mg??/DMSO：優(yōu)化PCR反應體系的離子強度和變性溫度。
目的：通過有限循環(huán)PCR（如10~15次）放大文庫，避免過度擴增導致偏好性。
（2）測序模板制備
單分子模板制備：
乳液PCR（emulsionPCR）：用于454焦磷酸測序，通過微珠包裹單個DNA片段進行擴增。
橋式PCR（BridgePCR）：在FlowCell表面生成DNA簇（如Illumina技術）。
核心試劑：
Phi29聚合酶：用于多重置換擴增（MDA），生成滾動環(huán)狀DNA（RDA）。
（3）測序反應體系
熒光標記與終止劑：
ddNTPs（雙脫氧核苷酸）：用于Sanger測序，終止鏈延伸并標記熒光。
可逆終止劑：Illumina邊合成邊測序（SBS）中使用，暫時阻斷鏈延伸后化學去除。
聚合酶與底物：
DNA聚合酶：催化核苷酸摻入（如Illumina的高性能酶減少錯誤率）。
引物與模板結合緩沖液：維持測序反應的高特異性。
更新時間：2025-07-18
點擊次數(shù)：247
當前位置：
上一個：
返回列表